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1、血球計數(shù)板法
血球計數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四條溝和兩條嵴,中央有一短橫溝和兩個平臺,兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm,每個平臺上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng),中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格.通過油鏡觀察,統(tǒng)計一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量,即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù).這種方法簡便,直觀,快捷,但只適宜于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進行計數(shù),并且所得結(jié)果是包括死細胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
2、染色計數(shù)法
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù),而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細胞和活細胞的不足,人們發(fā)明了染色計數(shù)法.借助不同的染料對菌體進行適當(dāng)?shù)娜旧?可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數(shù).如酵母活細胞計數(shù)可用美藍染色液,染色后在顯微鏡下觀察,活細胞為無色,而死細胞為藍色。
3、比例計數(shù)法
將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,即可得未知菌液的細胞濃度.這種計數(shù)方法比較粗放.并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準。
4、液體稀釋法
對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,根據(jù)估計數(shù),從三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共 15只裝培養(yǎng)液的試管中,經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù),然后查大或然數(shù)表MPN(most probably number)得出菌樣的含菌數(shù),根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量.該法常用于食品中微生物的檢測,例如飲用水和牛奶的微生物*。
5、平板菌落計數(shù)法
這是一種的活菌計數(shù)法.將待測菌液進行梯度稀釋,取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合,或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上.保溫培養(yǎng)后,用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度,即可算出原菌液的含菌數(shù).一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn) 50-500個菌落為宜.但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術(shù).平板菌落計數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養(yǎng),獲得了單克隆。
6、試劑紙法
在平板計數(shù)法的基礎(chǔ)上,發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數(shù)用.形式有小型厚濾紙片,瓊脂片等.在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基,其中加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng).短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量.試劑紙法計數(shù)快捷準確,相比而言避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。
7、膜過濾法
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經(jīng)丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光,活細胞會發(fā)橙色熒光,而死細胞則發(fā)綠色熒光。
8、生理指標(biāo)法
微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,例如酸堿度,發(fā)酵液中的含氮量,含糖量,產(chǎn)氣量等,與生長量相平行的生理指標(biāo)很多,它們可作為生長測定的相對值。
9、測定含氮量
大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%,酵母為7.5%,霉菌為6.0%.根據(jù)含氮量×6.25,即可測定粗蛋白的含量.含氮量的測定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測N2氣法.Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮氣,收集在呼吸計中,用KOH吸去CO2后即可測出N2的量.
10、測定含碳量
將少量(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻.加水稀釋至5毫升,在580nm的波長下讀取吸光光度值,即可推算出生長量.需用試劑做空白對照,用標(biāo)準樣品做標(biāo)準曲線。
11、還原糖測定法
還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況,常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測.方法是,離心發(fā)酵液,取上清液,加入斐林試劑,沸水浴煮沸3分鐘,取出加少許鹽酸酸化,加入Na2S2O3臨近終點時加入淀粉溶液,繼續(xù)加Na2S2O3至終點,查表讀出還原糖的含量。
12、氨基氮的測定
方法是:離心發(fā)酵液,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,加入底物18%的中性甲醛,反應(yīng)數(shù)刻,加入0.02N的使之變色,根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量.根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,可間接反映微生物的生長狀況。
13、其他生理物質(zhì)的測定
P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,產(chǎn)CO2(用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)),耗氧,黏度,產(chǎn)熱等指標(biāo),都可用于生長量的測定.也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化,終產(chǎn)氣量,微生物活性三方面的測定反映微生物的生長.如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上,隨時監(jiān)測溶氧量的變化和酸堿度的變化,判斷細菌的長勢。
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